外泌体是具有脂质双分子层的囊泡结构，纳米至微米级的颗粒，直径约为30-200nm, 比其他细胞外囊泡（EV）小，可由所有类型的细胞释放。外泌体在细胞间通讯中扮演关键角色，并参与多种生理和病理过程。这些纳米级别的结构不仅能够携带蛋白质、脂质、核酸等生物分子，还能穿透生物屏障，为靶向药物递送和基因治疗提供了一个全新的平台。
根据MISEV2023，外泌体天然存在于血液、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液、奶、固体组织、细胞培养上清液、微生物发酵上清液、和其他如植物中，理论上几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体。
上游(细胞、微生物来源)
对于细胞/微生物来源的外泌体，细胞培养方式分为贴壁培养和悬浮培养，微生物一般为悬浮培养。在贴壁培养工艺中，可采用转瓶、T型瓶、细胞工厂、片状载体固定床反应器、微载体3D培养。悬浮培养一般采用摇床、wave反应器或搅拌式生物反应器。
1. 贴壁培养
转瓶
细胞贴附于转瓶内壁生长。转瓶转动使培养液流动，利于细胞吸收营养并进行代谢；可使细胞接触气体，利于细胞的呼吸，促进生长和繁殖。
培养条件稳定
转瓶需要配合转瓶机在培养柜中进行培养，占地面积大，不易放大。更适合种子细胞的传代扩增
T型瓶
适合长期培养、传代、和培养种子细胞。瓶口较小，不易发生污染。适合在实验中选用，无法放大。
细胞工厂
细胞工厂相较传统的细胞培养瓶，可节约人力、物力，方便按比例扩增，可快速替代传统的转瓶培养，实现大规模的细胞培养。还可实现灌流培养，以进一步提高细胞的生长效果。
需要配合培养箱使用，占地面积较大。另外，耗材单批使用成本较高。
片状载体/微载体培养
片状载体和微载体培养，使细胞贴附在载体上，载体置于发酵罐中，结合了贴壁培养和悬浮培养的优点。相较细胞工厂，极大的提高了培养面积和培养体积比，在提高细胞产量的同时，无需使用占地面积大的设备，如转瓶和细胞工厂所需的培养柜。
2. 悬浮培养
摇床
摇瓶置于摇床中培养，可用于细胞传代和扩增。摇床能够提供均匀的营养分布和代谢废物排放，促进细胞生长和增值。操作简单，功能多样。
但是，摇床在运行当中可能会产生噪音和震动的问题，影响实验结果。
Wave反应器
一次性无菌反应袋放置在摇摆平台上，平台摇摆使培养基产生波浪，使培养物充分混匀，并提供气体传递，适合进行高密度的培养。由于细胞和颗粒物悬浮借助于波浪，气体传递无需鼓泡，运行过程中避免了搅拌桨和气泡造成的剪切。
由于混匀方式，波浪式反应器的zui大培养规模有限，无法实现大规模培养。可当做种子罐或小规模培养用，培养袋也可配置灌流单元，实现高密度培养。
搅拌式反应器
搅拌式生物反应器是生产过程中使用zui普遍、培养条件较容易优化的传统生物反应器类型。通过搅拌桨对培养体系进行搅拌和混匀，能够提供高效的混匀效果和传质。搅拌式反应器易于放大。
上游工艺方案
鲸智时代的WhaleStir台式生物反应器专门设计用于生物技术和生物制药应用中的细胞培养：
可选择300mL、500mL、1L、3L、5L、7L、10L、15L、20L的罐体，以满足工艺开发或工艺表征等不同培养规模的要求；
可根据悬浮培养或微载体3D培养等不同情景，选择不同的搅拌桨，满足混合、营养物质及氧气传质等要求，同时经过流体学设计的搅拌桨可zui大限度地降低剪切；
可选电热毯或夹套温控方式，并提供过热保护措施；
全自动反馈控制器采用先进PID反馈控制技术，配合高精度流量计和探头，实现精确通气和混合，对关键过程参数实现全方位的监测和自动控制；
提供通信端口和外接信号端口，实现远程控制和数据采集；
可实现一拖七的并行多联控制，方便数据分析和比较。
间充质干细胞培养基和添加物可用于临床级、药用级细胞培养，确保高效的细胞扩增效率，及所需的细胞数量和质量。
可用于多种来源的间充质干细胞的原代细胞分离及传代培养，如：脐带(hUCMSCs)、脂肪(hADSCs)、骨髓(hBMSCs)等，并保持细胞多向分化的潜能。无血清，无动物源组分，不含抗生素，性能稳定，批间差异小。高细胞扩增率，相同代次细胞数量远高于市场上同类型产品。
在生物反应器完全受控的工艺条件下，使用微载体可提供较高的表面积-体积比，即系统内生产表面可在一定程度上增加，这提高了产品的一致性，并降低了成本。微载体的尺寸、核心材料和表面涂层会影响微载体沉降和细胞生长，而细胞与微载体的接种比率也会影响细胞附着和均匀分布，所以选择合适的微载体并优化工艺参数对于获得理想的细胞数量和质量至关重要。
鲸智时代的药用级细胞仿生培养微载体已获得美国FDA DMF以及中国CDE药用辅料资质。该系列产品按照体内细胞贴壁生长弹性模量和贴壁曲率制备，可确保收获细胞的干性。结合封闭式细胞培养过程，避免手动操作的污染风险，且可通过简单地显微镜观察细胞在微球表面的生长，简化环境因素的检测和控制，提高可重现性和批次间一致性，并有利于节省系统占地空间，优化培养基利用效率。
下游
外泌体的分离纯化方法，根据MISEV 2023所述，外泌体的分离方法可根据EV的理化性质如粒径、密度、电荷和表面基团确定，具体有过滤/切向流过滤、聚合物沉降、差速(超速)离心、体积排阻层析、电荷/分子识别分离、密度梯度分离、场流分馏等方法。
过滤/切向流过滤
在过滤中，比膜截留孔径小的组分会穿过膜，比膜截留孔径大的组分会被截留。有一系列的孔径都可做为选择，如30/50/100/300/500/750 kDa，可允许过滤工艺在一定程度上实现体积排阻的功能。切向流过滤已经被证明可以应用在大规模外泌体生产工艺中。也可用于层析前的浓缩和缓冲体系的调整。
聚合物沉降
差速(超速)离心
通过不同转速的离心操作，逐级去除杂质并实现纯化。但是在逐级离心的过程中，可能会产生杂质或外泌体的聚集，或发生收率上的损失。
体积排阻层析
SEC可将不同粒径的微粒分离开，例如将EV类似尺寸的颗粒(如EVs、病毒、脂蛋白颗粒等)与非颗粒细胞外蛋白和游离蛋白分开。
体积排阻效果受一系列变量影响，如柱床粒径、孔径、装柱策略、径高比、流速、上样浓度等。
电荷和分子识别分离
利用EVs和其他组分的表面电荷差异，或识别EVs表面的特异性基团，进行亲和分离。这种方法可能分离出所有类型的EVs或非囊泡颗粒等所有具有相同电荷或相同表面基团的组分。特异性和收率取决于所选择分子或特性在整个体系中的特异性与普遍性。可根据工艺效率和选择性决定采用挂柱或流穿模式。
密度梯度分离
密度梯度分离可从EV中将特定的非囊泡颗粒或蛋白质分离。梯度由不同比例的介构成，含EV的物料可以bottom-up或top-down形式加载，之后进行超速离心。收集阶段必须小心谨慎以避免破坏梯度或收集到杂质组分。
由于原理限制，密度梯度离心可获得高纯度的料液，但是收率较低。在收获液中有密度梯度介质残留，需要去除。
流体流分离
基于场流分离的技术，可将EV和液体中的其他组分分离开，而无需依赖基质或固定相。目前在EV研究中主要使用场流分离和自由流电泳，场流分离中主要是非对称流FFF(AF4)。这种技术允许高杂质含量的物料输入，没有固定相可允许有更高的收率和更高的分辨率，分离条件也更加温和。
由于条件限制，处理量有限，可能不适合作为制备用途。
综上，外泌体分离方法尚无jue对zui佳，其分离效果与下游应用及科学问题密切相关，但高回收率和高特异性是公认的两个基本要求，另还需考虑操作流程的复杂程度、提取成本、生物活性、通量等。但据资料显示，基于尺寸的分离技术，如重力尺寸排阻色谱法（SEC），是一种速度更快、纯化效率更高的纯化方法，可以获得高纯度、完整的外泌体；此外，切向流过滤（TFF）也被认为是工程化分离外泌体的理想方法，TFF系统符合良好生产规范（GMP），是一种从大量细胞培养基中分离外泌体、浓缩蛋白或病毒的良好方法，多项研究证明，TFF分离的外泌体的产量和纯度与基于尺寸排阻色谱法的方法相当。
下游工艺方案
外泌体的下游工艺路线如下图所示：
在细胞培养收获后，可使用0.2/0.45/0.65μm的中空纤维过滤器搭载TFF切向流过滤系统进行收获液澄清
在层析前后需要对料液进行浓缩、换液，以满足层析或原液的需求，由于外泌体颗粒是剪切敏感的，建议使用中空纤维以减少剪切对样品的影响。孔径可根据粒径、收率需求、除杂效果需求，在300/500/750 kD中进行选择。
鲸智时代为生物工艺领域提供高质量的中空纤维产品，孔径范围3kD – 0.65μm，单支的膜面积500px2 – 16.6m2，纤维内径范围0.5 – 2.0mm，全面覆盖各种应用场景。组件材料无动物源，符合USP VI级别要求。针对特定工艺，提供可耐受在线蒸汽灭菌(SIP)的组件。每支中空纤维过滤器在出厂前均进行完整性检测，检测通过方可放行。
鲸智时代还可针对特殊应用，对中空纤维过滤器的纤维丝数量、膜面积、组件长度、接口方式、外壳结构等提供定制产品。
鲸智时代推出的TFF超滤系统是一款高效、多功能的生物分离与纯化设备，广泛应用于生物制药、细胞治疗、基因治疗及疫苗开发等领域。该系统采用先进的超滤技术，能够高效处理来自大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞的重组蛋白产物，如胰岛素、GLP-1和胶原蛋白等，实现快速收获、纯化与浓缩。在抗体领域，TFF超滤系统支持单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物（ADC）及抗体片段的浓缩与换液，确保产品的高纯度和稳定性。
在细胞治疗方面，该系统适用于T细胞、NK细胞、诱导多能干细胞（iPSC）及间充质干细胞（MSC）及外泌体的收获、浓缩和洗滤，为细胞治疗产品的制备提供可靠支持。在基因治疗领域，TFF超滤系统能够高效浓缩慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）等病毒载体，以及质粒DNA、mRNA、siRNA等核酸产物，同时支持脂质纳米颗粒等递送载体的浓缩与洗滤换液。此外，系统还可用于细胞外囊泡/外泌体的收获和浓缩，为基因治疗研究提供强大工具。
在疫苗开发中，TFF超滤系统能够浓缩病毒、病毒载体及病毒样颗粒，并支持基于重组蛋白的疫苗抗原的收获与纯化。同时，系统还可用于基于核酸的新型疫苗制备及新型佐剂的纯化，助力疫苗研发的高效推进。鲸智时代的TFF超滤系统以其卓越的性能和广泛的应用场景，成为生物医药领域不可或缺的核心设备。
